聚凝胺是一種多聚陽離子聚合物，常用于哺乳動物細胞的DNA轉(zhuǎn)染實驗以增強脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，作用機理可能是通過中和細胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進吸附作用。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑(肝素拮抗劑)，常用來生產(chǎn)非特異性凝集的紅細胞。
另外Polybrene也多用于蛋白測序，因為小劑量的Polybrene在自動測序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。
實驗1：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Retroviral Infection)
(1)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備：取5ml生長培養(yǎng)基(5%血清)加入約含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細胞的100mm培養(yǎng)盤內(nèi)。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45μm濾器過濾。
(2)待感染細胞的培養(yǎng)：100mm培養(yǎng)盤內(nèi)加入10ml*培養(yǎng)基，細胞密度為5×105/盤。
(3)病毒感染：細胞培養(yǎng)24h后，吸去*培養(yǎng)液。用含polybrene的2ml病毒上清 (或?qū)⒉《驹合♂尩?ml)感染細胞，polybrene的終濃度為5μg-10μg/ml。37℃孵育3-6h。
(4)收集病毒顆粒：加入8ml*培養(yǎng)基。感染3天后，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細胞。
實驗2：轉(zhuǎn)染
(1)*生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)細胞密度約50%;
(2)孵育細胞18-24h后準備DNA-培養(yǎng)基- Polybrene混合液，按如下操作制備混合液：①添加*培養(yǎng)基(60mm培養(yǎng)皿2ml，100mm培養(yǎng)皿3ml)，37℃預(yù)熱;②添加10ng~10µg質(zhì)粒輕輕混勻;③加入Polybrene至終濃度為5μg-10μg/ml。輕輕混勻。以上每個成分需要按順序加入。
(3)去除培養(yǎng)基，在細胞中加入DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液，在37℃孵育細胞6-20h。細胞培養(yǎng)的前6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻。
(4)去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution(15%DMSO in 1X HBSS)輕輕蓋住細胞(60mm培養(yǎng)皿3ml，100mm培養(yǎng)皿4ml)。每次加入溶液時用手輕晃培養(yǎng)盤10s，使得液體均勻分布。然后37℃孵育細胞4min。
(5)立即去除DMSO shock solution，用*生長培養(yǎng)基輕輕清洗細胞2次。對于60mm培養(yǎng)皿每次用5ml培養(yǎng)液清洗，100mm培養(yǎng)皿每次用10ml培養(yǎng)液清洗。
(6)加入*培養(yǎng)基到細胞中;
(7)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：去除生長培養(yǎng)基，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細胞。
瞬時表達：去除生長培養(yǎng)基，加入新鮮的生長培養(yǎng)基。24-72h后收獲細胞。